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本制品就是专门用于DNA非变性PAGE的试剂盒，一站式提供DNA非变性PAGE电泳所需的试剂，用户只需要准备去离子水和样品，不需要单独优化各种条件，十分方便。

在非变性PAGE中，DNA的迁移率除跟长短相关外，还跟其构象和结合的蛋白质相关，因此DNA的非变性PAGE电泳是研究SSCP-PCR（单链PCR片段构象多态性）和凝胶滞阻（Gel Shift）的重要研究手段。

• 安全，免去了实验人员接触粉末状的有毒物品丙烯酰胺。
  
• PAGE电泳后可直接用于银染等后续试验。
  
• 可以用于SSCP和Gel-Shift实验。
  
• 本制品足够30次mini PAGE凝胶电泳。

• PAGE浓度的选择
  根据SSCP-PCR和Gel-Shift的DNA长度选择PAGE凝胶的浓度。5%的PAGE的有效分辨范围为80～500bp、8%的PAGE的有效分辨范围为60～400bp、12%的PAGE的有效分辨范围为40～200bp。
  
• 体积的选择
  SSCP-PCR检测需要长约30～40cm的测序胶板，Gel-Shift实验一般只使用长度为8～10cm的mini凝胶，可以结合梳子的厚度，计算所需PAGE胶的体积。
  
• 配制PAGE胶
  下面以配制100mL PAGE胶为例计算用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加。
  
  • 新鲜配制10%的APS：称量约0.1克硫酸铵干粉到一个1.5mL EP管中，按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL自备去离子水的比例将水加到管中，摇晃到硫酸铵粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周，超过一周不能再用。
    
  • 新鲜配制30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将2g甲叉双丙烯酰胺倒入到装有60g丙烯酰胺的250mL棕色塑料瓶中，天平上去皮，加入146mL自备的去离子水，充分摇晃直到溶解（约需10～20分钟）。此溶液简称为30% AB溶液(29:1)，最好在一个月内用完，4℃保存。
    
  • 配SSCP PAGE胶：在一个250mL的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB溶液和10×TBE电泳液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
    

    PAGE胶浓度	去离子水(mL)	30% AB溶液(mL)	10×TBE电泳液	总体积
    5%	73.4	16.6	10mL	100mL
    6%	70.0	20.0
    7%	66.7	23.3
    8%	63.3	26.7
    9%	60.0	30.0
    10%	56.7	33.3
    11%	53.3	36.7
    12%	50.0	40.0

    • 有大量文献报道PAGE胶中加入5%～10%的甘油能提高SSCP分析时某些位点的分辨率。如果选择加入10%的自备甘油，则减少去离子水的用量10mL，同时加入10mL甘油原液。
  • 摇晃混匀。最好能抽真空10～15分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
    
  • 加入500μL 10%APS和100μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
    
  • 在PAGE胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
    
  • 室温聚合30～60分钟（低温抑制聚合反应，故最好室温）。
    
  • 待PAGE胶凝固后拔出梳子，用1×TEB液冲洗加样孔。
    
  • 放4℃冰箱预冷30分钟～12小时。为了防止PAGE胶收缩，最好在其顶部加少量1×TBE缓冲液。使用预冷的PAGE胶有利于单链DNA在电泳时保持其构型，这些构型靠DNA序列间的微弱的链内互补形成，对温度很敏感。温度越高，这些微弱相互作用越不稳定。
• 将预冷后的PAGE凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TEB电泳液。
  
• 取3～5μL SSCP-PCR样品，加入等体积2×DNA非变性PAGE上样液，85℃处理5分钟后冰浴。用前短暂离心后取2μL上样。上样量跟检测方法的灵敏度相关，上述上样量是针对核酸银染检测法。
  
• 连接电源线，打开电源开关。如果PAGE中不含甘油，则使用25W的功率，电泳5～7小时（对3～40cm长的PAGE胶而言）。如果使用含甘油的PAGE，则使用8W的功率，电泳16～18小时。由于温度变化过大会改变DNA构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
  
• 终止电泳，取出凝胶进行后续的银染处理。不建议使用灵敏度低于银染的方法，因为SSCP异构体的数量都比较少，一般方法没法检测到。

• 为何SSCP-PCR带型有复合条带？
  
  • 可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
    
  • 可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4～8倍后使用。
• 如何提高电泳分辨率？
  可以在配胶时加入甘油（终浓度为5%～10%），因为甘油是弱变性剂，能部分展开DNA折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合室温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。